一、实验目的:
了解显微镜的结构及油浸镜的工作原理,学会正确地使用显微镜。掌握简单染色的方法和步骤,并用油浸镜观察细菌形态。
二、实验材料
普通光学显微镜、香柏油、二甲苯、擦镜纸、实验一所得的细菌菌落。
三、实验步骤:
1.普通光学显微镜的构造
显微镜是一种高度放大的光学仪器、它的种类很多,根据实验目的不同,可分别选用普通光学显微镜、相差显微镜、暗视野显微镜、偏光显微镜、荧光显微镜及电子显微镜。
在微生物一般形态的观察中,普通光学显微镜最为常用,它的主要构造包括机械(包括镜座、镜臂、载物台、镜筒、物镜转换器、粗调螺旋和细调螺旋、推进器、聚光器升降螺旋等部件)。和光学部分(又可分为照明和放大两个系统,前者包括反光镜、聚光器和虹彩光圈,还有特殊的光源部件;后者包括物镜和接目镜)两部分。
显微镜的总放大倍数等于物镜放大率和目镜放大率的乘积。但显微镜性能的优劣不只是视其放大倍数的高低,而更主要的是视其辨析细微结构的能力,即性能良好的显微镜必须使被观察的物体放大倍数高,而且清晰。
显微镜辨析细微结构的能力可用分辨率表示,其能够辨析的细微结构越小,则分辨率越高。分辨率的高低,首先取决于物镜的性能,若设物镜分辨出的物体两点间的最短距离为D,则式中,λ为可见光的波长,平均为0.55μm;NA为物镜数值口径、镜口率或称开口率。数值口径NA是物镜和被检标本间介质的折射率n与镜口角(即入射角a)的半数正弦的乘积。
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由上可见,显微镜的分辨率与波长、介质折射率和镜口角(入射角)有关。λ越大,D值越大,分辨率越低;n和a越大,D值越小,分辨率越高。因此,可以通过缩短光线波长,增大介质折射率和加大镜口角(入射角)来提高分辨率。紫外光显微镜和电子显微镜就是利用短波光和电子波来提高分辨率的。但普通光学显微镜用的是可见光,波长一定,平均为0.55μm,而镜口角是指物镜光轴上的物点发出的光线与物镜前透镜有效直径的边缘所张的角度,理论上最大为1800,故sin(a /2)理论最大值为1(实际上镜口角度最大只能为1400),因此试图通过缩短波长或提高镜口角来提高光学显微镜的分辨率是有限度的。只有通过提高介质的折射率来提高数值口径,从而提高其分辨率。在使用低倍镜和高倍镜时,镜头与玻片标本间的介质是空气,其折射率是1,sin(a/2)=sin700=0.94,故其数值口径NA=1x0.94。使用油镜时,镜头与玻片标本间的介质是香柏油,香柏油的折射率为1.515,则其NA= 1.515 x 0.94,故油镜的数值口径总是大于低倍或高倍镜的数值口径,其数值口径最大可达到1.4,所以油镜的分辨率比低倍镜或高倍镜要高的多。
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